เวลาสองปีผ่านไป นับแต่ที่ ปีเตอร์ ปาร์กเกอร์ (โทบี้ แม็กไกวร์) หนุ่มนิสัยอ่อนโยน ได้เดินไปจาก แมรี่ เจน วัตสัน (เคิร์สเตน ดันสต์) หญิงสาวที่เขาหลงรัก มาเป็นเวลานาน และตัดสินใจ ที่จะเดินไปบนเส้นทาง เพื่อทำหน้าที่ รับผิดชอบ ต่อเพื่อนมนุษย์ ในฐานะของ สไปเดอร์แมน ปีเตอร์ต้องเผชิญหน้า กับความท้าทายใหม่ เมื่อเขาต้องดิ้นรน เพื่อรับมือกับ 'ของขวัญและคำสาป' จากพลังของเขา ในขณะที่ ต้องรักษาสมดุลย์ ของ สองตัวตน ทั้งใน ฐานะซูเปอร์ฮีโร่ ที่ไวเป็นปรอท อย่างสไปเดอร์แมน และการใช้ชีวิต ในฐานะนักศึกษา มหาวิทยาลัย ความสัมพันธ์ ที่ปีเตอร์รักที่สุด กลับต้องตกอยู่ ในอันตราย อันเนื่องมาจาก การเปิดเผยตัว เมื่อเขาต้องเผชิญหน้า กับ วายร้ายหนวดยุ่บยั่บ ที่มีพลังมหาศาล อย่าง ด็อกเตอร์อ็อคโตปุส หรือ ผู้มีฉายาว่า ด็อค อ๊อคก์ (อัลเฟร็ด โมลีน่า)

เมื่ออดีตดาราอเมริกันฟุตบอล พอล ครูว์ ถูกส่งเข้ามุ้งสายบัว ก่อนที่พัศดีจะบังคับให้เขาฟอร์มทีมอเมริกันฟุตบอลนักโทษชายที่ทีมไหนในโลกก็ไม่กล้าเหมือน และบรรดา นช. ก็ต่างพร้อมใจกันตั้งทีมเมื่อพบว่าคู่ปรับของเขาไม่ใช่คนอื่นไกล ก็แค่เหล่าผู้คุมสุดโอหังที่น่ารักน่าตื้บนั่นเอง

หญิงสาวไร้เดียงสาผู้ฝันอยากเป็นดาวจรัสแสงบนฟากฟ้าฮอลลีวูดยุค 50 พบรักกับคนขับรถหนุ่มชวนฝัน แต่หนทางกลับไม่ราบรื่นเพราะฮาเวิร์ด ฮิวส์ เจ้านายผู้มีนิสัยแสนแปลกของเธอ